Nicki von Tempelhoff machte sich zunächst als Bühnenschauspieler einen Namen, bevor er im Jahr 2000 in Oliver Hirschbiegels "Das Experiment" einem größeren Publikum bekannt wurde. Seitdem war er in zahlreichen Fernsehfilmen, -reihen und serien zu sehen.
Nicki von Tempelhoff wurde am 3. Oktober 1968 in Nordrhein-Westfalen geboren. Die Familie zog anschließend nach Holland, wo von Tempelhoff seine frühe Jugend verbrachte. Mit 15 Jahren kehrte er nach Deutschland zurück. Seine Ausbildung zum Schauspieler absolvierte von Tempelhoff von 1986 bis 1989 an der Münchner Otto-Falckenberg-Schule. 1990 erhielt er sein erstes Engagement an den Bühnen der Stadt Köln. Von 1995 bis 1999 gehörte er zum Ensemble des Thalia Theaters in Hamburg, bevor er 1999 an das Wiener Burgtheater wechselte und dort bis 2004 Ensemblemitglied war. Danach entschied sich von Tempelhoff als freiberuflicher Schauspieler zu arbeiten. Bis heute steht er immer wieder auf der Bühne. Gastengagements hatte er unter anderem an den Münchner Kammerspielen, am Düsseldorfer Schauspielhaus sowie am Deutschen Schauspielhaus in Hamburg. 2011 beeindruckte er an den Hamburger Kammerspielen als Jeffrey Skilling im Stück "Enron". Für seine Darstellung wurde ihm der Rolf-Mares-Preis verliehen. Häufiger ist der Mime inzwischen jedoch in Film- und Fernsehproduktionen zu sehen. Im Jahr 2000 machte er als "Wärter" Kamps in Oliver Hirschbiegels Film "Das Experiment" auf sich aufmerksam. Später spielte von Tempelhoff in Kinofilmen wie "GG 19 - Artikel 5" (2006), "Memory Effekt" (2006) oder dem Kurzfilm "Seine meine Schuld" (2011) mit. Wesentlich länger ist die Liste seiner Fernsehrollen. Dabei bewies der Schauspieler erstaunliche Vielseitigkeit. So spielte von Tempelhoff Episodenrollen in zahlreichen Krimi-Reihen von "Der Alte" über diverse "Sokos" bis hin zu "Der letzte Bulle". Ebenso häufig war er in Inga-Lindström- oder Rosamunde-Pilcher-Verfilmungen zu sehen und checkte wiederholt auf dem "Traumschiff" ein. Zu den aktuelleren TV-Arbeiten des Schauspielers zählt die TV-Komödie "Idiotentest" (2012), in der er neben Mariele Millowitsch zu sehen ist, sowie ein Auftritt in der Folge "Duft des Todes" aus der Vorabend-Krimiserie "Morden im Norden".
Nicki von Tempelhoff trennte sich 2009 nach einer langjährigen Beziehung von seiner Lebensgefährtin, der Schauspielerin Marie Bäumer. Mit ihr hat er einen Sohn, Shawn. Der Schauspieler lebt in Hamburg.