Nach kleinen Rollen in TV-Filmen und im Theater debütierte Penn 1981 in "Die Kadetten von Bunker Hill" an der Seite von Tom Cruise. Der Durchbruch gelang ihm 1984 mit "Der Falke und der Schneemann", der neben "Colors" (1988) zu den Filmen der 80er-Jahre zählt, die seinen Ruf als beachtlicher Schauspieler begründet und gefestigt haben.
Penn ist zumeist auf schwierige, rebellische sowie tragische Rollen fixiert, unter denen der zum Tode Verurteilte Matthew Poncelet in "Dead Man Walking" als seine Meisterleistung gilt, für die er auf der Berlinale 1996 als Bester Darsteller ausgezeichnet wurde. Die Intensität seiner Rollen brachte ihm den Spitznamen "Sean De Niro" ein, da dieser ebenfalls dafür bekannt ist, sich vollständig dem Charakter einer Rolle zu verschreiben.
In der Öffentlichkeit ist Penn ("Poison Penn") mehr durch einige Skandale (Prügeleien mit Fotografen, Drogen) denn durch seine Arbeit bekannt geworden, die den Medien nur selten Schlagzeilen wert war. Penn, der von 1985-89 mit Madonna verheiratet war, ehelichte 1996 die Schauspielerin Robin Wright Penn und hat zwei Kinder mit ihr. Im Winter 2002 erregte der erklärte Irak-Kriegs-Gegner Aufmerksamkeit, als er nach Bagdad reiste, um sich selbst ein Bild von den Zuständen im Irak zu machen.
Als Autor und Regisseur zeichnete er zunächst für die beiden Filme "Indian Runner" und "Crossing Guard" verantwortlich, die er ebenso wie Nick Cassevetes' "Alles aus Liebe" auch produzierte (für Letzteren erhielt er zudem in Cannes 1997 als Bester Darsteller die Goldene Palme).
Seine bislang beste Regiearbeit gelang Penn 2000 mit der Neuverfilmung von Friedrich Dürrenmatts "Das Versprechen", in der Jack Nicholson - in der Rolle, die im Vorläufer "Es geschah am hellichten Tag" Heinz Rühmann inne hatte - einen Polizisten im Ruhestand spielt, dessen verbissene Suche nach einem Mädchenmörder zur selbstzerstörerischen Obsession wird.
Seine Wandlungsfähigkeit als Schauspieler stellte Penn mit der Rolle des geistig behinderten Sam Dawson unter Beweis, dem im Melodram "Ich bin Sam" das Sorgerecht für seine Tochter entzogen werden soll. Nach einem Auftritt in Thomas Vinterbergs missglücktem "It's All About Love", in dem Penn als Philosoph buchstäblich über den Wolken über den katastrophalen Zustand der Welt sinnierte, ließ er 2003 gleich mit zwei Filmen aufhorchen: In Alejandro González Inárritus dramatischem Puzzle "21 Gramm" spielte er einen Collegeprofessor, der das Herz eines Unfallopfers transplantiert bekommt und sich schließlich zu dessen Witwe (Naomi Watts) hingezogen fühlt (für diese Rolle erhielt Penn den Hauptdarstellerpreis in Venedig), in Clint Eastwoods "Mystic River" wird Penn als Ex-Häftling Jimmy nach der Ermordung seiner Tochter von Rachegedanken getrieben, von denen ihn sein Jugendfreund, der ermittelnde Cop Sean (Kevin Bacon), abzubringen versucht. In Sidney Pollacks UN-Thriller "Die Dolmetscherin" soll Penn als Agent des Secret Service Hinweisen auf ein geplantes Attentat auf einen afrikanischen Diktator nachgehen und hegt dabei Verdacht gegen die Tippgeberin (Nicole Kidman).
Nachdem er 2004 für seine Darstellung in "Mystic River" einen Oscar und einen Golden Globe in Empfang nehmen durfte, wurde er von Steven Zaillian für die Hauptrolle in dem Südstaaten-Melodram "Das Spiel der Macht" besetzt. Als idealistischer Underdog Willie Stark, der das korrupte System kritisiert, steigt er zum machtbesessenen Politiker auf, der rücksichtslos und zynisch agiert und den selbst die Begegnung mit seiner Jugendliebe (Kate Winslet) kalt lässt. 2007 führte Penn in dem Spielfilm "In die Wildnis" nach der gleichnamigen Reportage von Jon Krakauer selbst Regie. Er schrieb das Drehbuch und engagierte Emile Hirsch für den Protagonisten Christopher McCandless, der sich mit wenig Ausrüstung auf eine abenteuerliche Reise nach Alaska macht. Danach war Sean Penn neben Harrison Ford und Ray Liotta in "Crossing Over" in der Rolle eines Grenzsoldaten zu sehen.
In der Satire "Inside Hollywood" nahm Penn neben Robert De Niro die Traumfabrik aufs Korn, dann folgte ein weiterer Oscar-Auftritt als homosexueller Bürgerrechtler Harvey Milk im gleichnamigen Biopic. "Fair Game" war solide Thrillerkost neben Naomi Watts, nun spielt Sean Penn im epischen Meisterwerk "The Tree of Life" von Regie-Künstler Terrene Malick groß auf: Als von seinem strengen Vater (Brad Pitt) gezeichneter Mann setzt er sich in dem von Zeitsprüngen und metaphorischen Bildfluten geprägten Werk mit den Grundfragen der Existenz auseinander.